强心苷作为治疗心力衰竭的特效天然药物，凭借其卓越的强心活性，已成为治疗心力衰竭的经典药物，也是药物研发史上的里程碑。其标志性结构特征之一，是甾体母核C14位连接有一个β构型的羟基。然而，在天然的甾体前体中，该位置却是一个α构型的氢原子。这一微小的立体化学差异，却成为化学家们人工合成强心苷的“阿喀琉斯之踵”——如何高效、精准地引入C14β羟基，一直是化学全合成及化学酶法合成面临的关键瓶颈。

现有合成策略如同“迂回作战”：或先在C14位附近构建碳碳双键再进行立体选择性水合，或先引入α构型羟基再经多步化学转化“翻转”为β构型。这些过程步骤繁琐、效率受限。一个核心问题悬而未决：能否“一步到位”，直接在甾体骨架上精准引入C14β羟基？

近日，这一难题迎来了破解的曙光。2026年2月20日，上海交通大学农业与生物学院、张江高等研究院合成科学创新研究中心刘振华团队在Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（PNAS）上发表题为“Plastid 2–Oxoglutarate-dependent Dioxygenases Mediate Stereoselective C14β-Hydroxylation in Cardenolide Biosynthesis”的研究型论文。该研究首次在夹竹桃科植物中发现了天然的甾体C14β羟化酶，能够直接催化目标羟基化反应，为革新强心苷的合成策略奠定了至关重要的酶学基础。

研究团队以夹竹桃科植物杠柳（Periploca sepium）为研究对象，整合基因组学、转录组学和代谢物分析，通过多组学关联分析，首先挖掘到催化强心苷前体孕烯醇酮合成的甾醇侧链裂解酶PsCYP87N10。

随后，通过与PsCYP87N10的基因表达关联分析，挖掘出20个潜在的甾体羟基化候选酶，包括13个细胞色素P450酶（CYP）和7个α-酮戊二酸依赖型双加氧酶（2OGD）。利用烟草瞬时表达与原核表达体外酶活验证，发现其中一个候选酶Ps2OGD4具有孕烯醇酮羟基化活性。核磁共振（NMR）与单晶衍射分析最终证实，该酶的产物正是14β-羟基孕烯醇酮，从而确证了其全新的C14β羟基化功能，该酶被重新命名为Ps14βPH。进一步的同位素示踪与植物体内基因沉默实验，证实了Ps14βPH直接参与杠柳中强心苷的生物合成途径。

研究团队发现，催化强心苷合成起始（侧链裂解）的PsCYP87N10与催化关键步骤（C14β羟基化）的Ps14βPH，在杠柳基因组中存在共线性及紧密连锁的现象，提示它们可能被协同调控。此外，Ps14βPH含有一段该植物科所特有的质体定位肽，可能引导其进入富含辅因子的植物质体中进行高效反应。系统发育分析显示，杠柳中的PsCYP87N10与之前在其他植物中报道的同类酶（CYP87A亚家族）分属不同进化分支。这些证据共同表明，夹竹桃科植物可能独立进化出了一套全新的酶学工具箱，专门用于合成强心苷这类复杂分子。

该项研究首次鉴定并表征了一类独特的2-酮戊二酸依赖型双加氧酶（2OGD），它能够特异性催化强心苷生物合成中“卡脖子”的C14β羟基化反应。这项发现不仅为理解植物如何进化出复杂特化代谢途径提供了范例，更重要的是，为未来通过合成生物学策略，实现高价值强心苷药物的绿色、高效生物制造，提供了强大且创新的“酶学武器”。

本研究由上海交通大学长聘教轨副教授刘振华担任通讯作者，上海交通大学农业与生物学院博士研究生王建华、周玄和助理研究员姬文娟为该论文的共同第一作者，上海交大药学院长聘教轨副教授侯四化和博士后李权哲为本研究的X射线单晶衍射分析提供了重要技术支持，本研究得到国家自然科学基金的资助。

原文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2525003123