近日，上海交通大学药学院、张家高等研究院糖化学生物学中心王平课题组开发了一种新型邻近驱动蛋白连接策略IEDDA （IAN，IEDDA-assisted Native Chemical Ligation），依托光可裂解甲基吡啶（Pic）连接子与超快生物正交反应，实现了在极低浓度条件下的高效蛋白连接，为大分子、疏水蛋白低成本、温和条件合成提供通用化学工具。

  化学蛋白合成可制备重组表达无法获得的带特殊翻译后修饰蛋白，是化学生物学核心技术。但传统的天然化学连接方法反应动力学受限，必须使用毫摩尔级高浓度肽段才能实现有效偶联；而分子量较大、疏水性强的蛋白仅在微摩尔稀溶液中稳定，高浓度下极易聚集沉淀，大幅降低合成成功率。其次，现有低浓度辅助连接策略需要在固相多肽合成阶段提前引入，无法对体外表达蛋白进行后期修饰，与表达蛋白连接（EPL）技术不兼容；且辅基脱除需三氟乙酸、高强度紫外等苛刻条件，易破坏蛋白敏感修饰基团。

图1. 研究背景

交大研究团队基于前期开发的甲基吡啶（Pic）光控修饰骨架，构建携带四嗪（Tz）、双环壬炔（BCN）两种反应基团的光可裂解 Pic 连接子，通过IEDDA快速点击反应，将两个蛋白片段“锁定在局部高有效浓度空间”，再触发NCL反应完成连接。搭建IAN全新合成策略。

图2. IEDDA-assisted Native Chemical Ligation（IAN）策略的建立

在模型反应中，作者系统评估了IAN策略在不同浓度条件下的反应效率，建立了“IEDDA点击 → NCL连接 → 光脱连接基元“三阶段级联反应体系，该策略可在25μM超低浓度条件下，仍保持高效率反应（93%），显著突破了传统多肽连接策略对浓度的依赖。与此同时，对照实验中，传统NCL反应在0.2mM条件下产率接近零。这一结果表明，作者发展的IAN策略显著降低了蛋白连接对浓度的依赖，实现了低浓度体系中的高效偶联。

图3. IAN策略用于不同间距及连接位点的多肽合成

为验证该策略的适用范围，研究团队进一步构建了多种不同结构背景的底物体系。首先，作者系统考察了Tz与BCN连接位点之间的间距影响，结果表明：即使连接位点间距扩展至29个氨基酸残基，体系仍可保持约95%产率，说明该策略对蛋白柔性构象具有较强适应能力。随后，作者进一步将体系扩展至不同C端硫酯肽，尤其是具有明显空间位阻的Val与Ile硫酯肽。结果显示，在IAN策略下，所有目标肽段均可高效生成，而在对照NCL体系中几乎无法检测到目标产物。这一系列结果表明，作者发展的IAN策略能够有效克服传统NCL对位阻敏感的问题，具有更广泛的底物适用性。

同时，该策略修饰灵活，可后期修饰合成肽与表达蛋白

Tz/Pic、BCN/Pic 两类连接子可在蛋白/肽合成完成后，靶向修饰半胱氨酸巯基，实现定量偶联；同时突破半胱氨酸数量限制，修饰位点可拓展至赖氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸等十多种氨基酸侧链，底物适用范围极广。

超快生物正交反应构建邻近效应，大幅提升局部有效浓度

利用逆电子需求狄尔斯 - 阿尔德（IEDDA）反应 —— 水溶液中二级速率常数高达 10⁶ M⁻¹s⁻¹，能快速将两条蛋白片段拉近，依靠分子内邻近效应消除稀溶液带来的动力学障碍，实现微摩尔浓度高效连接。

全流程温和水相，一锅三步无需中间提纯

整套反应在水溶液中连续完成，无需分步分离纯化：第一步 IEDDA 快速偶联拉近蛋白链；第二步开展天然化学连接/表达蛋白连接形成天然酰胺键；第三步可见光催化无痕脱除 Pic 连接子，仅需 20W 普通荧光灯、弱酸性环境 20 分钟即可完全清除辅基，无残留修饰损伤蛋白结构；整套体系还可同步兼容自由基脱硫反应，进一步拓宽连接位点。

图4. IAN在难溶蛋白（G-CSF）合成中的应用

随后，作者进一步将该策略扩展至SARS-CoV-2 spike protein RBD片段，实现表达蛋白片段之间的高效连接，成功构建嵌合蛋白体系。值得注意的是，在相同条件下，传统NCL方法在低浓度体系中无法实现有效连接，进一步凸显了IAN策略在表达蛋白化学合成中的优势。

图5.  IAN辅助嵌合蛋白G-CSF-RBD的合成

IAN 策略实现固相合成肽 + 体外表达蛋白通用适配，彻底打破低浓度蛋白合成的技术壁垒。整套工艺条件温和，不会破坏蛋白翻译后修饰，一锅式简化操作流程，大幅降低大分子、疏水蛋白合成门槛。相关成果以“Proximity-Driven Protein Ligation Beyond the Concentration Limit”发表于《Journal of the American Chemical Society》上。上海交通大学博士生尹建辉和博后刘新亮为共同第一作者，王平教授和叶发荣助理研究员为通讯作者。