近日，上海交通大学张江高等研究院、生命科学技术学院瞿旭东教授团队与厦门大学王斌举教授团队合作完成的研究论文发表于《美国化学会志》（J. Am. Chem. Soc.）。该研究围绕二酮哌嗪（DKP）天然产物结构多样化形成中的一个关键机制问题，阐明了细菌P450酶催化C3–N1′二聚化连接的双自由基偶联机制，并在团队前期对多种DKP偶联反应持续研究的基础上，提出以“自由基加成—双自由基偶联”为核心的统一催化框架，为理解DKP天然产物结构多样性的生物合成规律提供了新的机制认识。

二酮哌嗪（DKP）是由两个氨基酸缩合形成的最小环肽骨架，具有结构稳定、易于进一步修饰等特点，广泛存在于天然产物中。其中，P450酶可催化含色氨酸的DKP单体发生位点选择性的氧化偶联，由相似的底物生成具有不同连接方式和立体构型的二聚体，由此显著扩展其结构与功能多样性。依据参与偶联的结构单元类型，这些反应可分为DKP二聚化与DKP-核碱基偶联两大类；其中，DKP二聚体按偶联位点的区域选择性又可细分为非对称型（C3–C6′、C3–C7′、C3–C8′、N1–C7′、C3–N1′）和对称型（C3–C3′）。此类天然产物大多可同时存在于细菌和真菌中，并具有多样的生物学活性。上述反应引出了一个长期悬而未决的科学问题：相似的酶与底物如何产生如此多样的连接方式？其背后是否存在共同的催化规律？

图1. 自然界中已知的具有不同偶联方式的二酮哌嗪（DKP）二聚体

围绕这一科学问题，瞿旭东团队长期开展DKP天然产物生物合成与酶促结构多样化研究。2018年，团队发现并表征了细菌来源首个可催化非对称型C3–C6′和C3–C7′二聚体形成的P450酶，揭示分子内自由基反应与分子间自由基加成在吡咯并吲哚形成及C3–C6′/C3–C7′偶联中的作用（Nat. Commun. 2018, 9, 4428）；2020年进一步鉴定N1–C7′偶联酶，发现N1–C7′与C3–C6′/C3–C7′不同区域选择性的偶联酶具有高度相似的初始双底物结合构型，而催化过程中的构象动态决定最终连接方式（Nat. Commun. 2020, 11, 6251）。在此基础上，团队开发分枝杆菌全细胞催化体系（J. Org. Chem. 2021, 86, 11189），并通过酶工程实现近百种非对称型DKP二聚体的多样性合成（Angew. Chem. Int. Ed. 2023, 62, e202304994）。随后，团队又分别阐明了C3–核碱基偶联的自由基加成机制（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2024, 121, e2412890121）和C3–C3′对称二聚化中的自由基加成/单电子转移机制（J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 49），逐步建立起对DKP酶促偶联反应的系统认识。

图2. TtpB2、TtpB1及其突变体催化环二肽cWW二聚化的产物分析

(a)分别向表达TtpB1和TtpB2的耻垢分枝杆菌中添加cWW后，所得DKP衍生物的HPLC分析。(b)以cWW为底物，在Fd/FdR及NADPH存在的条件下，TtpB1及其突变体TtpB1-M7和TtpB1-M9体外催化反应产物的HPLC分析。

在这一系列研究中，C3–N1′连接是已知细菌DKP二聚化中最后一种尚缺乏机制解释的偶联模式。催化该连接的P450酶TtpB2此前已由Shuming Li团队报道（Chem. Commun. 2020, 56, 11042），但其反应机制一直未被阐明。尤其是，团队此前建立的自由基加成模型可以解释C3–C6′/C7′、N1–C7′、C3–核碱基和C3–C3′等连接方式，却难以合理解释C3–N1′键的形成。因此，解析这一反应不仅是补齐DKP二聚化机制图谱的关键，也关系到能否从整体上建立该类P450氧化偶联反应的统一认识。

由于天然C3–N1′二聚化酶TtpB2难以获得可溶性蛋白，研究团队以可溶性良好的同源酶TtpB1为研究基础。TtpB1天然催化C3–C3′连接，团队通过结构指导的组合突变获得了主要生成C3–N1′产物的TtpB1-M9变体，从而建立了可用于机制研究的替代体系。底物交叉偶联实验和酶–双底物复合物晶体结构表明，不同连接方式的酶仍保持高度保守的双底物结合框架，两个底物分别采取U形和L形构象，提示偶联方式的差异并非源于完全不同的底物结合模式，而主要来自催化过程中的底物运动与自由基演化。
进一步结合分子动力学（MD）模拟、伞形采样和QM/MM计算，团队揭示了C3–N1′键形成的双自由基偶联路径：P450首先从一个底物的二酮哌嗪氮原子夺取氢，形成N10位自由基；随后第二个底物发生构象调整并靠近催化中心，再经氢原子抽提生成N1′位自由基；在两个自由基依次形成后，第一个底物发生分子内环化产生C3位自由基，最终与第二个底物的N1′位自由基直接偶联，构建C3–N1′键。这一结果揭示了由自由基生成、底物构象变化、环化到分子间偶联的精细时空协同过程，并确立了区别于经典自由基加成的另一类P450偶联机制。

图3. QM/MM计算验证双自由基偶联机制

基于上述结果，团队将已知细菌P450催化的DKP二聚化反应归纳为两类基本路径：其一为“自由基加成”，即一个底物先被活化为自由基，随后向另一底物发生加成；其二为本研究揭示的“双自由基偶联”，即两个底物依次被活化形成自由基，再经环化和自由基重组形成新的连接。两类反应共享保守的双底物结合框架，但可通过自由基生成位点、反应时序及构象动态的差异实现机制切换，从而形成不同的连接模式。酶工程实验进一步验证了这一框架的可调控性：除将TtpB1从C3–C3′偶联重编程为C3–N1′偶联外，L175F单点突变即可使其主要形成N1–C7′产物，并伴随少量C3–C7′产物。由此，同一P450骨架及其变体可实现C3–C3′、C3–N1′、N1–C7′和C3–C7′四类分子间偶联，显示出该类酶在天然产物结构创新中的显著催化可塑性。

图4. P450催化不同偶联模式DKP二聚化反应的机制总结

从非对称DKP二聚化酶的发现与机制解析，到核碱基偶联和对称型二聚化机制的揭示，再到本研究补齐C3–N1′连接机制，团队通过系列工作逐步建立了对P450催化DKP结构多样化的系统认识。本研究提出的“自由基加成—双自由基偶联”统一框架，将不同连接方式纳入共同的催化逻辑之中，不仅深化了对天然产物结构多样性形成规律的认识，也为利用P450酶开展新型氧化偶联反应设计、天然产物及其类似物的定向合成提供了理论基础。

上海交通大学杜叶青和成都中医药大学/厦门大学周太平为论文共同第一作者；上海交通大学瞿旭东、魏广证和厦门大学王斌举为共同通讯作者。该研究得到国家自然科学基金、中国博士后科学基金、云南省科技人才与平台计划和国家重点研发计划的支持，并获得国家蛋白质科学研究（上海）设施及上海同步辐射光源相关线站的技术支持。

论文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.6c16809