光致发光（Photoluminescence, PL）是一种自发辐射跃迁现象。PL成像技术具有高灵敏度和高空间分辨率，因此在生物医学成像、材料科学研究和化学分析中有着广泛应用。然而，不同发光标记物的发射信号在一维光谱空间中易于重叠，这限制了PL成像中可独立检测的标记物数目。传统PL成像方法通常依赖4-5种不同的发光颜色对目标进行标记。在交大+Science125个科学问题中，化学领域的第一个问题就是：还有更多色彩元素可发现吗？一种解决思路是，在多维度条件空间中编码PL信号，发现新的多维“颜色”。

针对上述科学问题，上海交通大学化学化工学院、张江高等研究院长聘教轨副教授严畅与美国加州大学圣地亚哥分校熊伟教授等人合作开发了一种基于超快飞秒激光脉冲技术的新型宽场显微镜（MD-WISE技术）。MD-WISE技术使用超快飞秒红外脉冲调制发光探针的电子能级跃迁过程，该技术既适用于分子探针也适用于量子点探针。如图1所示，该技术运用中红外波段的超快脉冲与可见光波段的超快脉冲接连作用于样品，并收集脉冲作用后产生的光致发光信号用于成像。该技术通过三个独立可调的参数调制光致发光信号的强度：红外与可见光脉冲之间的时间延迟t、可见脉冲波长λ_Vis、红外脉冲的光学频率ω_IR。这组条件构建了一个富含信息的三维空间，从而能够区分一维发射光谱几乎相同但化学结构不同的光致发光探针。

此外，大部分基于非线性光学原理的显微技术依赖共聚焦扫描成像模式，但MD-WISE技术可在宽场成像模式下工作，在低光损伤条件下进行大视场高速成像。这一研究提高了成像的多重性和化学选择性，开拓了光致发光成像的新方向，使其能够在生物、材料科学中进行更复杂的化学分析和动态过程观察。

图1 MD-WISE显微技术的核心在于其独特的信号编码机制，通过调控红外和可见光脉冲之间的时间延迟（t）、可见脉冲的波长（λ_vis）和红外脉冲的频率（ω_IR）三个独立变量影响光致发光信号强度，实现对发色物的精确区分。

作者首先探究了MD-WISE技术第一种原理——调制染料分子的光学吸收截面，这种机制基于分子的双共振吸收过程。红外光脉冲选择性激发分子内特定振动模式，使得分子的电子能级跃迁吸收截面发生改变，进而导致发光强度变化。基于这一机理，作者进行了荧光素（fluorescein）和异硫氰酸荧光素（FITC）的区分实验（图2）。两者的化学结构仅相差一个-N=C=S基团，紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱近乎重叠，在常规的荧光成像中无法直接区分两种染料。但通过红外光选择激发FITC特有的异硫氰酸基，MD-WISE技术成功地区分了两种染料所染的二氧化硅小球。这一原理要求红外振动激发先于电子能级跃迁发生。

图2  常见染料分子荧光素与异氰酸酯基取代荧光素的区分。如图E所示，在t = 1 皮秒、λ_Vis = 520 nm、ω_IR = 2040 cm^-1的激发条件下，异氰酸酯基取代荧光素的光致发光强度受红外脉冲的调制，而荧光素的光致发光强度则不受红外脉冲调制，因此有或无红外脉冲激发时的发光强度差值可以区分这两种标记物。

作者接着探究了MD-WISE技术的第二种原理——强场中红外脉冲对量子点（Quantum dots, QDs）光致发光强度的影响。中红外飞秒脉冲可以通过场强达到兆伏每厘米（MV/cm）的瞬时强电场破坏量子点中的电子-空穴对（即激子）。当中红外脉冲光波的电场足够强时，它可以驱动量子点中的激子超越其束缚势垒，导致电子和空穴分离。电荷分离态的形成降低了激子的复合概率，从而显著降低了量子点的发光量子产率。由于这种原理属于先激发后调制的过程，与上述第一种原理在脉冲时序上相反，可以用于区分发光波长相近的量子点与分子染料。利用相同的中红外激发波长但不同的激发时序，作者成功实现了量子点与分子染料的区分（图3）。

图3  通过调整脉冲之间的超快延迟时序来区分发射光谱高度重叠的量子点和分子染料。在上述组图中，时间延迟t = -10 皮秒，即可见脉冲先于红外脉冲抵达样品。当时间延迟为负数时，分子染料发光信号不受红外脉冲调制，而量子点染料发光信号会被红外光淬灭。在有或无红外脉冲激发的发光强度的差值成像中，量子点的信号可以被选择性地区分于分子染料信号。

最后，作者在量子点（细胞膜染色）和碘化丙烷分子（细胞核染色）的共染色实验中验证了MD-WISE在单色通道宽场成像实验中区分同一细胞中不同组分的能力（图4）。

图4  通过调节红外和可见脉冲之间的超快延迟t在红光单通道宽场成像模式下分辨量子点染色的细胞膜和碘化丙啶染色的细胞核。当t = -10 皮秒时，细胞膜信号可从碘化吡啶的背景中被选择性地区分出来。

综上所述，MD-WISE显微技术为光致发光成像提供了一种高度灵活且具有潜在广泛应用的新方法。通过利用多维编码策略，这项技术提升了成像的多重性，能应对传统成像技术中遇到的发射光谱重叠问题。展望未来，MD-WISE显微技术有望在细胞分析、复杂生物组织研究以及新材料开发中发挥重要作用。此外，通过进一步优化设备和成像算法，期望该技术能够在实时生物过程监控和高通量分子筛选中实现更广泛的应用。

上述研究成果近期以“Multidimensional Widefield Infrared-Encoded Spontaneous Emission Microscopy: Distinguishing Chromophores by Ultrashort Infrared Pulses”为题发表于《美国化学会志》（Journal of the American Chemical Society ）上。

论文信息：

C. Yan, W. Xiong, et al. J. Am. Chem. Soc. 2024, 146 (3), 1874–1886.

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.3c07251