近日，国际权威期刊The Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS)在线发表了上海交通大张江高等研究院超快科学研究中心研究团队的合作成果“Elucidation of a distinct photoreduction pathway in class II Arabidopsis thaliana photolyase”。通讯作者为超快科学中心丁蓓教授和仲冬平教授。第一作者为超快科学中心的周中能、陈子净和江秀文博士。

在生物体内，DNA光解酶（PL）和隐花色素（Cry）分别在DNA修复和光感应的扮演着关键角色。它们具有色氨酸（Trp）三联体或存在第四个酪氨酸（Tyr）生成光还原网络（图1），但其DNA修复的量子产率低于I光解酶。为了深入理解II类光解酶的光还原机制，研究团队展开了一项开创性的研究。他们利用突变设计和飞秒光谱技术，成功揭示了拟南芥II类光解酶（AtPL）的独特光还原机制。这一发现不仅为光解酶家族的功能多样性提供了新的启发，也为未来相关领域的研究开辟了新的方向。

图1. I类光解酶和II类光解酶的不同光还原途径。虚线箭头用于指示电子流动的方向。I类光解酶途径：大肠杆菌光解酶（EcPL，PDB代码1DNP）中的传统Trp三联体途径以灰色显示。II类Trp途径：AtPL中的电子转移Trp三联体和第四个Tyr分别以绿色和蓝色显示，而它们之间的电子转移距离也被标记。AtPL的结构通过Alphafold3预测。

通过设计W387F突变体阻断AtPL里的电子传递链，研究团队在研究中发现，AtPL的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅因子中，黄素（Lf）和腺嘌呤（Ade）之间的内部分子电子转移（ET）展现出独特的反向动力学。它们之间的正向电子转移（fET）时间常数为 172 ps，反向电子转移（rET）时间常数仅为 26  ps（图2），这与 I 类的EcPL ^[1]中的正常动力学截然不同。通过Marcus电子转移理论来估算其中的电子转移重组能，我们发现两类光解酶的重组能不同，这有可能归因于II类光解酶因为结构原因而具有更多的水分子在FAD所在腔内。

图2. 在特定波长下的瞬态吸收动力学进行动力学分析。图中显示了W387H、W366F和 W394F在 760 nm （A、D、G）和514nm（B、E、H）下的瞬态动力学分解。W387H 突变体（B）在 514 nm 处的信号强度被放大了 3 倍。分解后的动力学曲线有 Lf*、Lf˙⁻/Ade˙⁺、Lf˙⁻/W₃₈₇˙⁺、Lf˙⁻/W₃₆₆˙⁺ 和 ³Lf，插图是绘制到 120 ps的动力学曲线。用于拟合 W387H（C）、W366F（F）和 W394F（I）的动力学模型和拟合参数也显示在右侧，其中拟合参数用红色表示，分析中固定的参数用黑色表示。

研究团队深入探究了拟AtPL中从Lf到最近的色氨酸（W_a）的电子转移速率，利用W366F突变体进行了一系列实验。通过数据分析鉴定了在W366F中W387与Lf之间的正向电子转移（fET）时间为22 ps，反向电子转移（rET）时间为171 ps（图2）。通过Marcus电子转移理论来估算，该fET的ΔG⁰约为-0.58 eV而重组能为1.10 eV（fET）。W394F突变体的实验还发现，W_a到W_b的电子跃迁在能量上不利，利用它们之间的 fET（156 ps）和rET（40 ps）寿命可以估算出其fET 的ΔG⁰约为0.04 eV，这与在I类的EcPL ^[1] 中观察到的能量有利电子跃迁现象不同，表明AtPL中存在独特的电子转移机制。这样一个能量上坡的ET步骤说明了为什么 II 类的 AtPL 的光还原量子产率（约34%）低于 I 类的EcPL（约45%）。

通过设计Y351F突变体，研究团队还捕捉到拟南芥 II 类光解酶远端 Trp 残基 W_c 的快速去质子化现象（图3）。W_c 在光还原过程中于 3 ns内快速失去质子，生成中性自由基 W_c˙。这一现象也呼应了 II 类的MmPL ^[2] 中W_c的快速去质子化过程。这种快速去质子化不仅凸显了 II 类光解酶光还原机制的独特性，还可能与其蛋白运动紧密相关，未来将进一步探索其生物学意义及在光解酶进化中的作用。本研究深入研究了II 类的 AtPL光还原机制，这有助于未来人工光酶的设计和光受体研究。此外，本研究还引发了关于 II 类光解酶独特的光还原网络，启发了II 类光解酶蛋白骨架为什么如此进化的重要科学问题。

图3. 这里总结了 AtPL 光还原过程中形成的基元反应步骤，以及它们的氧化还原电势和对驱动力及重组能的之间的关系。（A）AtPL 野生型的光还原网络（8 个电子转移步骤和 1 个质子转移步骤，并配有拟合的时间常数）。（B）包括 Lf/Lf˙⁻、Ade˙⁺/Ade、W₃₈₇˙⁺/W₃₈₇、W₃₆₆˙⁺/W₃₆₆和 W₃₉₄˙⁺/W₃₉₄在内的中间物种的还原电位。（C）所有 8 个电子转移步骤的电子转移速率与自由能（ΔG⁰）和重组能（λ）的二维图。为了与报道的 EcPL 结果^[1]进行对比，所有 8 个电子转移步骤均采用了距离依赖参数 β = 1.4 Å⁻¹。其中，两个与 Lf 相关的电荷复合步骤（5-1 和 4-1）位于 Marcus 电子转移反转区（-ΔG⁰ > λ），而其余的电子转移步骤则位于 Marcus 正常电子转移区域（-ΔG⁰ < λ）。

该项工作得到了科学技术部（2020YFA0509700）及国家自然科学基金（22373067、12004246、22433003）的支持。

论文链接：https://www.pnas.org/doi/abs/10.1073/pnas.2416284121

参考文献：

1. Z. Liu, et al., Determining complete electron flow in the cofactor photoreduction of oxidized photolyase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 12966–12971 (2013).

2. P. Müller, E. Ignatz, S. Kiontke, K. Brettel, L.-O. Essen, Sub-nanosecond tryptophan radical deprotonation mediated by a protein-bound water cluster in class II DNA photolyases. Chem. Sci. 9, 1200–1212 (2018).